Gli insediamenti nell'area dove oggi sorge Isernia, risalgono all'era paleolitica, almeno 700.000 anni fa: il sito archeologico vicino la città chiamato La Pineta è infatti stato citato sulla rivista "Science" come uno dei più antichi siti dove l'uomo ha usato il fuoco. Del resto, la presenza di due corsi d'acqua rendeva il territorio particolarmente favorevole all'insediamento umano. Le origini di Isernia sono antichissime e non si può definire una data certa. Sicuramente molte notizie storiche provengono dalle guerre sannitiche ma, guardando la struttura della città, si nota la presenza di mura ciclopiche che di solito venivano edificate dai Pelasgi popolo presente anche in Campania. Non è da escludere però che queste mura ciclopiche furono edificate anche da popoli aborigeni.
La città fu, come tutte le altre città dell'Italia centro meridionale, sotto il dominio Sannita fin dal V secolo a.C.. Fu durante le Guerre sannitiche che si ebbero le prime notizie certe sulla città (nell'anno 295 a.C., quando era già caduta nelle mani dei Romani). La posizione della città si dimostrò subito molto strategica per l'espansione di Roma, costituendola porta d'accesso del Sannio. Dopo le prime vittorie, i romani posizionarono delle colonie in punti strategici ai confini con i territori sanniti; una di queste colonie fu insediata proprio nella città nel 264 a.C., a cui venne cambiato il nome in Vulcano Esernio, cioè città dedicata al dio Vulcano (come era d'uso ai Romani dedicare le città a qualcuno degli Dei). Isernia è nuovamente menzionata anche nel 209 a.C. come una delle diciotto colonie che rimasero fedeli a Roma nel periodo più difficile della seconda guerra punica.