Isernia si trovava, nel IV secolo, su un'arteria di grande rilevanza, cioè quella che collegava Aufidena con Aequum Tuticum. Era riportata come Serni Civitas nell'Itinerarium Antonini, come Esernie nella Tavola Peutingeriana e nel Cosmografia ravennate e come Isernia da Guido da Pisa.
Dopo la caduta dell'Impero romano, Isernia venne distrutta nel 456 dai Vandali, capitanati da Genserico, per ben tre volte dai Saraceni, negli anni 860, 882 e 883, e saccheggiata da Marcovaldo di Annweiler nel 1199.
Nel corso del VII secolo i Longobardi posero la città a capo di una contea e promossero un certo sviluppo: favorirono la costruzione della chiesa di Santa Maria, con annesso il monastero delle Monache Benedettine, e diedero un nuovo assetto urbanistico alla città. Inoltre nel 667, Alzecone duca dei Bulgari, dopo essere entrato in Italia con tutto il suo esercito e aver chiesto a Grimoaldo ospitalità in cambio della sua fedeltà, si vide assegnati i territori di Isernia e zone limitrofe dallo stesso re longobardo.
Nel tardo Medioevo, ad Isernia fiorì una vera e propria scuola giuridica di livello europeo, di cui il maggiore esponente fu Andrea da Isernia.
